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土壤基因组DNA提取试剂盒
R3960 BMASSAY
700.00 / 50T
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产品说明 / Product Overview:


土壤样品存在大量的抑制因子如腐殖酸、金属离子等,而纯化的DNA 中只要有这些微量物质的存在,都会影响到PCR等酶促反应。
该土壤基因组DNA提取试剂盒采用独特的腐殖酸去除液能够有效去除腐殖酸;吸附柱CG能能有效去除金属等抑制因子,提纯得到的基因组DNA可直接用于PCR 反应,酶切或定量实验。

准备工作:
1. 准备55℃,70℃水浴;无水乙醇;异丙醇;制冰机;1.5ml离心管;2ml离心管
2. 按照标签所示在漂洗缓冲液PW中加入无水乙醇;缓冲液R5中加入异丙醇,混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。
3. 每次使用前请检查缓冲液R2,缓冲液R3是否有沉淀生成,如果出现沉淀,37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

标准操作步骤:
如非指出,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1. 称0.3-0.5 g土壤置于2ml离心管中,加入0.4 g Glass Beads,再加入700 μl 缓冲液R1与100 μl 缓冲液R2。涡旋器高速震荡3-5min。
注意:对含水量丰富的样品,可以预先离心除去部分水分后再称取样品。缓冲液R2是腐殖酸去除剂,100μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤, 缓冲液R2的量可以适当增加,但不能超过250 μl,否则会严重影响DNA的得率。
 
2. 加入100 μl 缓冲液R3(R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用),涡旋混匀。 70℃水浴处理10 min。期间振荡几次。
注意:如果要纯化革兰氏阳性菌的DNA,请在70℃处理完后,再90℃水浴处理2min。
 
3. 12000 rpm(~13,000g)离心1分钟,取600μl上清到1.5ml离心管中,加入180 μl 缓冲液R4混匀。
注:转移上清时确保不要吸取到沉淀,转移的上清量最好不超过80%。
 
4. 冰上放置5分钟。12000 rpm(~13,000g)离心1分钟。 转移上清到新的1.5ml离心管中。
注:转移上清时确保不要吸取到沉淀,转移的上清量最好不超过80%。
5. 加入与上清等体积的缓冲液R5(使用前请检查是否已加入异丙醇),颠倒混匀。
6. 取750 μl混合液加到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000 rpm(~13,000g)离心30秒,倒掉滤出液。
7. 将剩余的混合液加到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12000rpm(~13,000g)离心30秒,倒掉滤过液。
8. 向吸附柱CG中加入500μl 漂洗缓冲液WB1,12,000 rpm (~13,000×g )  离心30 秒,倒掉废液。
9. 向吸附柱CG中加入600μl 漂洗缓冲液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000 rpm (~13,000g) 离心30 秒,倒掉废液,吸附柱CG放入收集管中。
10. 向吸附柱CG中加入600μl漂洗缓冲液PW,12,000 rpm (~13,000g) 离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CG放入收集管中。
11. 12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注:此步骤非常重要,其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。
 
12. 将吸附柱CG转入一个干净的1.5ml离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50–100 μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟,12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟。
注:
① 洗脱缓冲液体积最好不少于50 μl,体积过小影响回收效率。
② 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。
 
13. DNA产物-20℃保存。

大量操作步骤(针对含微量核酸的样品)
1. 称1-5g土壤置于10ml离心管中,加入1g Glass Beads,再加入3ml 缓冲液R1与200μl 缓冲液R2。涡旋器高速震荡3-5分钟。
2. 加入600μl 缓冲液R3,涡旋混匀。70℃水浴处理10分钟。期间振荡几次。
3. 3000g离心3分钟,转移上清到新的离心管中,加入550μl 缓冲液R4混匀。
4. 冰上放置5分钟。8000g离心10分钟。转移上清到新的离心管中。
5. 以下按标准操作步骤的第五步继续操作。

DNA浓度及纯度检测:
 
基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0%琼脂糖凝胶,使用λ/HindIII判断基因组的大小,完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时, OD260/OD280比值应为1.7–1.9之间,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水洗脱,比值可能偏低,但并不表明DNA纯度不高。

产品储存:
试剂盒在室温(25℃左右)干燥条件下,可保存1年。缓冲液R2和R3可能有沉淀产生,若溶液产生沉淀,应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。
 
 

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