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氯膦酸盐脂质体(Clodronate liposomes)常见问题
2020-12-22 552 分享到:

为什么氯膦酸盐脂质体可用于研究巨噬细胞功能?


巨噬细胞在免疫系统中起着重要作用。它们主要通过可溶性分子,如细胞因子和趋化因子的介导来调节许多非吞噬细胞的功能。巨噬细胞还通过摄取和消化微生物或非自身颗粒和大分子而参与人体的“体内平衡”。消化则是由溶酶体酶介导。

脂质体是人工制备的脂质囊泡,由夹带水性隔室的同心磷脂双层组成。它们可用于封装溶解在水溶液中的强亲水性分子,例如氯膦酸盐(clodronate),一种开发用于人的无毒双膦酸盐。

注射后,氯膦酸盐脂质体起特洛伊木马的作用。巨噬细胞吞噬氯膦酸盐脂质体并消化脂质体膜。氯膦酸盐不被消化,会保留在巨噬细胞内。随着更多的氯膦酸盐摄入和消化更多的氯膦酸盐脂质体,更多的氯膦酸脂质体会在巨噬细胞内积聚。在一定的细胞内浓度下,氯膦酸盐将通过启动程序性细胞死亡(即凋亡)来清除巨噬细胞[1]。

通过选择氯膦酸盐脂质体的正确给药途径,可以耗竭特定的器官或组织中的巨噬细胞。因此,氯膦酸盐脂质体是研究巨噬细胞功能的极佳工具[2]。

1. Van Rooijen, N., & Hendrikx, E. (2010). Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. In Liposomes (pp. 189-203). Humana Press.

2. Van Rooijen, N., Sanders, A., & van den Berg, T. K. (1996). Apoptosis of macrophages induced by liposome-mediated intracellular delivery of clodronate and propamidine. Journal of immunological methods, 193(1), 93-99.


氯膦酸盐(脂质体)的半衰期是多少?


从死亡巨噬细胞中释放的氯膦酸盐的半衰期(t1⁄2)约为数分钟[3],因为游离的氯膦酸盐可以通过肾脏系统迅速从循环中被清除。 由于难以通过细胞膜,包括脂质体磷脂双层,游离的氯膦酸盐分子不容易进入细胞。 然而,如果它们保留在周围的介质中,它们可能会慢慢积累到细胞中[4]。

氯膦酸盐脂质体的半衰期很难确定。 脂质体很难从血液中分离出来,它们在动物体内的分布也不均匀。 此外,氯膦酸盐脂质体的半衰期取决于巨噬细胞摄取和消化所需的时间,这由许多因素决定,例如:动物模型的免疫能力、给药途径、给药剂量。

3. Fleisch, H. (2000). Bisphosphonates in bone disease: from the laboratory to the patient. Elsevier.

4.Claassen, I., Van Rooijen, N., & Claassen, E. (1990). A new method for removal of mononuclear phagocytes from heterogeneous cell populations in vitro, using the liposome-mediated macrophage ‘suicide’ technique. Journal of immunological methods, 134(2), 153-161.

没有观察到巨噬细胞耗竭,可能是什么原因?

氯膦酸盐脂质体活动失败的原因可能有多种:


1.过期日期已过:过期日期后无法保证活动;

2.在极端温度下存储:氯膦酸盐脂质体应在4至8摄氏度之间存储。脂质体的冻结或高于30摄氏度的温度会影响膜的稳定性并降低氯膦酸盐脂质体的活性;

3.脂质体悬浮液的稀释:这会影响悬浮液中的渗透压,这可能导致脂质体膜的不稳定;

4.管理协议不足:应仔细选择协议,并取决于多个因素,例如:

a. 您打算消耗的巨噬细胞类型(例如,枯否细胞,小胶质细胞,肺泡巨噬细胞,破骨细胞)。例如,气管内给药可靶向肺泡巨噬细胞,而该给药途径不会靶向内皮/上皮屏障另一侧的间质巨噬细胞。

b. 您是否打算短期或长期耗尽它们;

c. 动物的体重:较大的动物需要更多的氯膦酸盐脂质体才能消耗。

5.脂质体悬浮液在使用前未重悬:脂质体在储存过程中易于沉淀,在使用前确保通过轻轻摇动使其重悬,以防止仅注射不含脂质体的PBS溶液。

6.注射时出了点问题:确认注射是否成功很重要。例如,如果您在尾静脉静脉注射过程中看到灯泡形成,则可能是您错过了尾静脉。腹膜内注射时,请确保将脂质体悬浮液注射入腹膜腔内(而不是肠内)。为了验证脂质体是否已到达所需的位置,可以使用荧光DiI脂质体。

7.测量耗竭的方法不足:需要选择正确的标记来确定耗竭是否成功。此外,您还需要考虑到每种给药方案和(动物)模型的巨噬细胞耗竭和繁殖动力学不同。

注意

我们在全球拥有众多购买脂质体产品的客户。当我们收到有关注射氯膦酸盐脂质体后巨噬细胞耗竭不足的报告时,我们总是检查其他客户是否报告了类似的观察结果。到目前为止,我们很高兴通知您我们尚未遇到此问题。

注射(氯膦酸盐)脂质体后动物死亡,可能是什么原因?

实验动物在注射(氯膦酸盐)脂质体后几个小时或几天后死亡


这很可能是在注射之前或注射过程中不久由微生物污染引起的。注射氯膦酸盐脂质体时,巨噬细胞的耗竭会使动物更容易受到感染。

注意:腹膜内注射(ip)很复杂,污染的风险更高。如果您注射ip,我们建议确保使用乙醇(100%)刮毛和清洁皮肤,因为存在将活在皮肤上的细菌与针头一起带入小鼠的巨大风险。

实验动物在注射(氯膦酸盐)脂质体后立即死亡


这很可能是由于注射了非均质的沉淀脂质体。沉淀的脂质体可能引起栓塞,从而部分或完全阻塞动脉或静脉中的血流。由于脂质体在储存过程中易于沉淀,因此请确保在使用前轻轻摇晃使其重悬。

另一个原因可能是脂质体悬浮液的温度。脂质体应存储在4至8摄氏度之间,但应在室温下给药。

注意:如果注射时间太长,脂质体可能会在注射器中沉淀,当使用同一注射器注射多只动物时,这可能会导致剂量不同。


如何储存脂质体悬浮液?


存放在4 – 8ºC(或39 – 47ºF)之间。脂质体悬浮液不得冷冻,也不要暴露于极端高温下。


氯膦酸盐脂质体悬浮液的浓度是多少?


平均而言,整个脂质体悬浮液的浓度为5毫克氯膦酸盐/毫升。氯膦酸盐以CH 2 Na 2 Cl 2 O 6 P 2 ·5 H 2 O的形式封装在脂质体囊泡中。

脂质体的大小和电荷是多少?


我们所有的脂质体(即氯膦酸盐,PBS和荧光DiI脂质体)均带负电荷,因此不会一起阻塞。悬浮液中的脂质体没有大小,这意味着它也包含越来越大的脂质体(最大3微米)。平均而言,脂质体的大小为1.7微米。

脂质体悬浮在哪种介质中?


我们所有的脂质体制剂(即氯膦酸盐脂质体,对照脂质体和荧光的DiI脂质体)悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS):10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, >140 mM NaCl。

如何检测DiI标记的脂质体?


标记有荧光染料DiI或DiI标记的脂质体的对照脂质体可用于研究脂质体是否通过选定的给药方案达到了目标巨噬细胞群体。荧光标记将显示脂质体在组织中的分布方式以及它们被巨噬细胞摄取的情况。DiI标记的脂质体可以通过流式细胞术的荧光显微镜检测。DiI分子的激发和发射分别为549和565 nm(见图)。

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如何在发表文章中署名Liposoma?


如果您在实验中使用我们的脂质体制剂并打算发表您的发现,请称为“Liposoma, the Netherlands (clodronateliposomes.com)”