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JaICA产品常见的技术信息
2021-02-07 561 分享到:

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在此页面,我们汇总了有关使用JaICA产品过程中经常遇到的技术问题及其故障解决的信息,应用实例和参考文献链接。如果您的问题不在其中,可以通过电子邮件与我们联系。



新/高灵敏8-OHdG检测ELISA试剂盒 New/ Highly Sensitive 8-OHdG Check

1.适用动物

问:哪种动物适用于8-OHdG ELISA?

答:适用于人,小鼠,大鼠,兔,狗,牛,马等人的尿液样品。8-OHdG Check ELISA试剂盒可检测尿液、血清、血浆、血细胞、组织和培养细胞中的8-OHdG。8-OHdG ELISA产品有两种类型,其检测范围不同。对于尿液样品,“ New 8-OHdG Check”是合适的。对于血清和组织样品,我们建议在样品预处理后应用于“高灵敏度8-OHdG Check”。

样品的预处理程序可能会有所不同,具体取决于样品的类型。请确认样品的预处理程序。如果您打算测量尿液样品中的8-OHdG,请在应用于ELISA之前从尿液中去除细胞和不溶性物质。


2.样品稀释


问:样品稀释应使用什么?

答:建议使用 磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)。如果尿液样本来自健康人,则样本可以直接用于“ New 8-OHdG Check ELISA”,但如果尿液样本来自患者,我们建议使用PBS将样本稀释2或4倍。


3.尿液8-OHdG的稳定性

问:应如何保存尿液样本?

答: 已知8-OHdG具有化学稳定性。尿液样品可以在室温下保存3天,在4°C下可以保存7天。但是请注意细菌的污染。如果使用盐酸防止细菌生长,请在应用ELISA之前先调节pH值。

尿液样本可以在-80°C下保存更长的时间,长达数年。但请避免重复冻结/解冻周期。当冷冻的尿液样本解冻时,在某些情况下可能会观察到不溶物。在应用于ELISA之前,请先通过离心除去不溶物。


根据最近的论文,如果将尿液样本保存在-80°C以下,则至少可以稳定两年。

Y Matsumoto等,J Occup Health 50,p366-372(2008)


4.适用样品类型


问:哪种样品适用于8-OHdG ELISA?

答: 除了尿液样本外,血清/血浆,腹水样本,人工透析的外部液体和唾液样本还已知可用于8-OHdG ELISA。这些样品需要进行预处理。从血细胞,精子,器官和培养细胞中分离的DNA样品可用于8-OHdG ELISA。


[唾液的分析实例]

临床健康和牙周病患者的整个唾液中氧化DNA损伤的新生物标记物证据。M Takane等。等,J Periodontol.73(5),p551-554(2002


5.正常人尿液中的8-OHdG浓度:


A)平均浓度:13.6 ng / mL(250男性)和10.3 ng / mL(250女性)

B)8-OHdG排泄比:8.6 ng / kg / h(250男性和250女性)

C)肌酐校正:8.4 ng / mg CRE(250位男性和250位女性


6.尿液采样和校正:

随机尿液中的8-OHdG浓度不稳定,具体取决于个体差异,样本采集时间,性别和其他一些因素。为了获得最佳结果,请租用采样和更正方法。


关于肌酸酐校正:

肌酐校正是获得稳定数据的一种好方法。但是它不适合对运动对氧化应激影响感兴趣的一些研究人员。那是因为运动会增加肌酐的浓度。


1)重复运动对人体尿中8-羟基-脱氧鸟苷排泄的影响。自由基自由基。1997年6月; 26(6):507-14。冈村K等 等

在本文中,每天使用8-OHdG排泄物评估跑步的影响。观察到尿中的8-OHdG显着增加(从265.7 +/- 75.5 pmol / kg /天增加到335.6 +/- 107.4 pmol / kg /天)。


2)惯常的长距离跑步不会增强8-羟基脱氧鸟苷的尿排泄。Eur J Appl Physicol Occup Physiol。1997; 75(5):p467-469。皮尔杰A,et。等

在本文中,通过尿中的8-OHdG和肌酐校正来评估跑步的效果。8-OHdG和肌酐浓度均增加。但是,运行到8-OHdG水平的影响并不显着(0.12-6.45 µmol / mol CRE)。


7.故障排除:

请点击此处以查看新的8-OHdG Check ELISA试剂盒的技术提示。

8.血清/血浆样本:

为了检测血清和血浆样品中的8-OHdG,需要进行预处理。请通过超滤去除蛋白质,并应用于“高敏感度8-OHdG检查”。有关更多信息,请点击这里。

9.采血管:

血液采集管是可商购的。例如,NIPRO代码30-122是合适的。请注意,如果将全血在室温下放置数小时,则血清中的8-OHdG浓度可能会增加。我们建议在采血后20分钟内开始离心。血清样品必须在-20°C以下保存。

10.人血清8-OHdG:


男性血清中的8-OHdG浓度高于女性。吸烟者的血清8-OHdG高于非吸烟者。

参考:吸烟习惯与日本农村居民血清8-OHdG,氧化的LDL抗体,Mn-SOD和类胡萝卜素水平之间的关系.J Epidemiol 2003; 13(1):p29-37.Suzuki K等。


11.组织样本中的8-OHdG:


从组织或细胞中提取的DNA水解后,可以使用“高度敏感的8-OHdG检查”测量8-OHdG水平。

参考:苯并[a] py与紫外线A的共同暴露诱导人皮肤成纤维细胞中8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷的形成:抗氧化剂的预防作用。环境毒理学与药理学12,2002,37-42


12.DNA提取:


为了测量组织样品或培养细胞中的8-OHdG,必须通过NaI方法提取DNA。用于DNA提取的基于NaI的试剂盒可商购获得。例如,

DNAextractor®TIS试剂盒(WAKO Chemicals,代码296-67701) 可能有用。


参考文献:

ML Hamilton等。使用碘化钠法分离DNA可以可靠地评估核和线粒体DNA中的8-oxo-2-deoxyguanosine水平。

核酸水库。29(10),p2117-2126(2001)


HJ Helbock等。等 DNA氧化问题:8-氧代-脱氧鸟嘌呤和8-氧代鸟嘌呤的HPLV电化学检测方法。

美国国家科学院院刊95,p288-293(1998


13.测量组织或细胞中8-OHdG所需的样品量:


问:测量组织或细胞中的8-OHdG所需的样品量是多少?

答:这取决于实验,但是,在健康的人体组织中,通常每8 dG中存在8-OHdG在10-6和10-5之间。使用“高度敏感的8-OHdG检查”可以在0.125-10ng / mL之间测量8-OHdG,因此,为了检测8-OHdG,我们当然建议制备200 µg / 135µL DNA


14.核酸酶P1试剂:


您也许可以从当地代理处找到用于生化试剂的核酸酶P1酶。


15.关于氩替代:


问:“用于检测组织DNA中8-OHdG的氩取代”是什么意思?

答:氩气替代是用氩气替代空气(含氧气)。那是因为纯化的DNA可能在氧气存在下被氧化。为了防止样品制备过程中发生氧化,我们建议对试剂和样品进行“氩气替代”。将氩气轻轻吹入装有样品溶液或试剂的试管中。但是,如果立即进行实验,则不需要氩气替代。

参考:CG Fraga等。等:衰老过程中对DNA的氧化损伤:大鼠器官DNA和尿液中的8-hydroxy-2'-deoxyguanosine。美国国家科学院院刊87,p4533-4537,1990


16.组织样品的预处理:(什么是Chelex®处理?)


据报道,在痕量二价金属离子存在下,DNA可以通过Fenton反应被氧化。可以通过Chelex®树脂(Chelex®是BioRad Laboratories的注册商标)去除二价金属离子。为获得可靠的结果,应使用Chelex®处理过的水检测DNA样品中的8-OHdG。

17.找不到Ultrafree-MC:

可以使用Microcon YM-10(Millipore,目录号42407)。

18.测量样品数:


问:使用一套试剂盒可以测量多少样品?

答:如果要在N = 3中进行实验,则可以测量18个样品(总共54个测定)。一种ELISA试剂盒包含96孔微量滴定板。

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在某些情况下,在孔的顶部和底部,可以观察到“边缘效应”引起的方差误差。尽管为获得可靠的数据统一准备了所有井,但建议不要在顶部和底部排中使用井。3孔6层(总共18孔)将用作标准液。结果,可以将54个孔用于样品。


19.如何计算结果:

问:哪种算法适合标准曲线?

答:如果算法函数是近似半对数曲线(吸光度=反对数,浓度=对数),则可以替代地使用任何算法函数来计算结果。尤其是由于最近的酶标仪具有绘制标准曲线的有用功能,因此可以使用它。半对数折线图也足以用作近似函数。


如果您没有适当的软件,请随时通过标题为“ ELISA试剂盒校准”的电子邮件将您的法律数据发送给我们。我们会将您的原始数据转换为8-OHdG浓度。


20.ELISA试剂盒的部分使用:

问:ELISA试剂盒可以部分使用几次?

答:ELISA试剂盒由8孔* 12列组成,因此可以相应地划分以满足被测样品的数量。请注意,每次测量样品都需要一条新的校准曲线。对于校准曲线,需要6个水平* 3 = 18孔。低于-20°C储存时,几乎所有样品均保持稳定。因此,当您同时测试所有样本时,可以测量更多样本。


21.卵巢子宫内膜瘤的检测实例:

要检测卵巢子宫内膜瘤溶液中的8-OHdG,请通过离心或过滤除去粘性成分,然后按照与血清样品相同的方法通过超滤除去蛋白质。

卵巢子宫内膜瘤:0.58 ng / mL 8-OHdG

浆液性膀胱腺瘤:0.06 ng / mL 8-OHdG

粘液性囊腺瘤:未检测到8-OHdG。

参考:藤井S,日本生物铁学会第31次会议,Abstruct in Japanese p9-10(2007


22.使用哪种微孔板读取器?

任何带有450nm滤光片的酶标仪都适用。

23.使用DNase I水解DNA的协议:

在以下论文中提出了方案建议:

高效液相色谱-质谱法测定DNA中的8-羟基-2'-脱氧鸟苷:与气相色谱-质谱法进行比较。核酸研究29(3)E12(2001) .Dizdaroglu M,Jaruga P,Rodriguez H


增加了老年啮齿动物视网膜色素上皮和脉络膜的线粒体DNA损伤并下调了DNA修复酶。Mol Vis 14 p644-651(2008)Wang AL,Lukas TJ,Yuan M,Neufeld AH。


24.参考波长:

600-650 nm。

25.8-OHdG ELISA的特点:

用于8-OHdG Check ELISA的单克隆抗体(克隆N45.1)对8-OHdG具有高度特异性。据报道与8-OHdG类似物(鸟苷(G),7-甲基-G,6-SH-G,8-溴-G,dA,dC,dT,dI,dU,dG,O6-甲基-dG,8-OHdA,鸟嘌呤(Gua),O6-甲基-Gua,8-OH-Gua,肌酐,8-巯基-G,8-OH-G)小于8% OHdG。

[参考文献] S.Toyokuni等人:单克隆抗体N45.1定量免疫组织化学测定8-羟基-2'脱氧鸟苷:其在次氮基三乙酸铁诱导的肾癌模型中的应用。实验室 投资。76(3),p365-374(1997)


26.肌酐测定:

肌酐浓度的调整对于评估尿液样本中的8-OHdG很有用。肌酐测定试剂盒可商购。

LabAssay™肌酐,代码。290-65901, WAKO化学Co.Ltd。

该试剂盒可用于人和动物的尿液。


查看产品:KOG-200SE KOG-HS10 




Anti 8-OHdG / 8-oxo-dG antibody

1.适用品种:

适用于测试人类,兔子,大鼠等多种动物的组织样本。对于来自小鼠组织样品的小鼠IgG,必须采取一个步骤。例如,Vector MOM免疫检测试剂盒可用于小鼠组织样品。据报道,可以观察到具有较低背景的小鼠血管的优良免疫组织化学图像。当内源性过氧化物酶活性引起背景问题时,建议使用碱性磷酸酶作为标记。

2.协议:

免疫组织化学检测方案可在此处获得。

3.免疫组化条件:


问:8-OHdG免疫组织化学的意义是什么?

答:染色条件应根据样品的种类或条件来决定。通常, 正常细胞中存在10 -6 / dG的8-OHdG。许多研究报告称,氧化应激的增加使8-OHdG的含量增加了百分之几或几倍。如果无法观察到样品与对照组织之间的明显差异,则应改变染色条件,例如一抗的浓度或其他因素。另外,在羟基自由基的产生者如H 2 O 2或UV的存在下,正常DNA的氧化可产生8-OHdG 。请避免使用H 2 O2用于阻断内源性过氧化物酶活性。我们建议碱性磷酸酶作为标签。染色的部分主要是细胞核。


4.适用于培养细胞:

问:在抗原回收过程中,培养的细胞从载玻片上脱落。怎么预防呢?

答:这取决于电池的类型或实验条件,但在某些情况下,电池很容易从载玻片上脱落。在这种情况下,建议使用Bouin溶液代替福尔马林溶液进行固定。Bouin固定的样品可以染色而无需抗原回收。


5.内源性生物素的阻断:

可能有必要阻断肾脏,肝脏,前列腺和肠组织的内源性生物素。在这种情况下,请在一抗反应之前封闭内源性生物素。

1)与0.001%抗生物素蛋白/ PBS孵育10-15分钟。

2)用PBS洗涤

3)与0.001%生物素/ PBS孵育10-15分钟。

4)用PBS洗


6.冷冻样品:

抗8-OHdG单克隆抗体可能适用于冰冻切片,但未经测试。

7.小鼠组织:(通过德克萨斯红色检测。)

1)阻止内部生物素(载体)。

2)封闭内源性小鼠IgG(MOM试剂盒,Vector)。

3)抗8-OHdG抗体(5 µg / mL,室温下30分钟)。

4)生物素抗小鼠IgG在室温下放置10分钟。

5)德克萨斯红抗生物素蛋白(10 µg / mL)。

参考:Fujihara等,PLoS ONE 3(9),e3119(2008)


8.来自人的培养细胞:(通过Fluor488检测)。


1)用4%多聚甲醛固定。

2)RNase 100 µg / mL,10mM Tris-HCl pH7.5,1mM EDTA,0.4M NaCl(37°C,1小时)。

3)蛋白酶K 10 µg / mL(室温下7分钟)。

4)4N HCl处理(室温下7分钟)。

5)PBS中的0.2%TritonX。

6)抗8-OHdG抗体(按1:50稀释)。

7)Fluor488-抗小鼠IgG山羊抗体(以1:200稀释)。

参考:李亚,在。等,Biol Pharm Bull 31(6)p1265-1269(2008


查看产品:MOG-020P / MOG-100P

己酰赖氨酸(HEL)ELISA试剂盒

1.适用动物

HEL ELISA试剂盒有望应用于人、兔、大鼠和其他实验动物,因为脂质氧化是许多物种常见的。直到今天,人尿液、狗尿液和猫尿液都经过测试。

我们想与研究人员分享有关氧化应激研究的任何信息,并希望为您的研究做出贡献。如果您对HEL分析有任何经验或想法,请随时提交至我们的邮箱(sales@zhscience.com)


2.应用于人尿液:

建议用PBS(pH7.4)稀释(x 4)。正常人尿液中的HEL浓度预计为:

平均105.4 +/- 67.0 nmol / L。

平均85.1 +/- 61.8 pmol / mg肌酸酐。

平均77.2 +/- 54.9 pg /小时公斤体重。


3.适用于人血清:

需要通过蛋白酶对样品进行预处理才能检测血清样品中的HEL。

[样品预处理步骤]

1)将1体积的血清与1体积的PBS(pH7.4)混合。

2)准备酶溶液【PBS(pH7.4)中的14mg / mL的α-胰凝乳蛋白酶】。

3)将300 µL稀释的血清加入60 µL酶溶液。

4)在37摄氏度下孵育过夜(10-18小时)。

5)将反应混合物应用于分子截留值为10kDa的超滤器中,以去除蛋白酶和高分子量物质。例如,Microcon YM-10(美国密理博)是合适的。

6)收集滤液并用于HEL ELISA。

[测定例]

正常人血清中的HEL浓度为7.96±4.32 nmol / L


4.适用于动物样本:

1)狗尿液:

建议用PBS稀释4倍。测定实施例14-58nmol / L。

2)猫尿液:

建议用PBS稀释10倍。测定实施例108-298nmol / L。

3)小鼠尿液:

建议使用PBS稀释20倍。4)大鼠血清:

与人血清相同的异丙酚。测定实施例25.8nmol / L。


5.在LDL中检测HEL:

可以在氧化的LDL中检测到HEL。需要样品预处理。

[样品预处理步骤]

1)将纯化的LDL或氧化的LDL透析至PBS(pH7.4)。

2)向100 µL样品中加入100 µL胰蛋白酶(在PBS中为40 mg / mL)和2 µL CaCl 2溶液(100 mM)。

3)在37°C下孵育过夜(10-18小时)。

4)将反应混合物应用于截留分子量为10kDa的超滤器中,以去除蛋白酶和高分子量物质。例如,Microcon YM-10(美国密理博)是合适的。

5)收集滤液并用于HEL ELISA。

[测定例]

天然人LDL = 13.6 nmol / L的HEL水平,氧化人LDL = 363.6 nmol / L的HEL水平


6.应用于组织样本:

预计将通过以下过程检测到HEL。

[样品预处理步骤]

1)在含0.1%BHT(丁基化羟基甲苯)的PBS中制备组织匀浆。

2)离心,收集上清液。

3)准备酶溶液(PBS(pH7.4)中的14 mg / mL的α-胰凝乳蛋白酶)。

4)在300 µL上清液中加入60 µL酶溶液。

5)在37°C下孵育过夜(10-18小时)。

6)将反应混合物应用于截留分子量为10kDa的超滤器,以去除蛋白酶和高分子量物质。例如,Microcon YM-10(美国密理博)是合适的。

7)收集滤液并用于HEL ELISA。

注意)BHT可能难溶于PBS。请准备BHT /乙醇溶液,并在开始制备匀浆之前将BHT溶液添加到PBS中。


7.适用于培养细胞:

可以通过以下步骤在培养的细胞中检测到HEL。

[样品预处理步骤]

1)在6孔板中培养细胞以达到融合。

2)将培养基换成无血清。

3)用PBS洗涤细胞3次。

4)用600 µL PBS(pH7.4)刮擦细胞。

5)加入0.1%BHT(丁基羟基甲苯),并通过超声处理制备细胞裂解液。

6)离心,收集上清液。

7)在300 µL上清液中加入60 µL酶溶液。

8)在37°C下孵育过夜(10-18小时)。

9)将反应混合物应用于截留分子量为10kDa的超滤器中,以去除蛋白酶和高分子量物质。例如,Microcon YM-10(美国密理博)是合适的。

10)收集滤液并用于HEL ELISA。


8.如何准备标准曲线:

如果算法函数是近似半对数曲线(吸光度=反对数,浓度=对数),则可以替代地使用任何算法函数来计算结果。尤其是由于最近的酶标仪具有绘制标准曲线的有用功能,因此可以使用它。半对数折线图也足以用作近似函数。

9.ELISA试剂盒的部分使用:

ELISA试剂盒由8孔* 12列组成,因此可以相应地划分以满足被测样品的数量。请注意,每次测量样品都需要一条新的校准曲线。对于校准曲线,需要6个水平* 3 = 18孔。低于-20°C储存时,几乎所有样品均保持稳定。因此,当您同时测试所有样本时,可以测量更多样本。

10.参考波长:

600-650 nm将用作参考波长。

11.α-胰凝乳蛋白酶:

α-胰凝乳蛋白酶可从Sigma-Aldrich获得。

代码C-4129,来自牛胰腺的α-胰凝乳蛋白酶。II型,250毫克,40单位/毫克蛋白质


12.超滤装置:

MilliporeMicrocon®YM-10已停产。

Nanosep®离心装置(MW切断:10kDa的,编码OD010C34。)从 Pall公司可以是用于样品预处理是有用的。


查看产品:KHL-700E

抗己酰赖氨酸(HEL)抗体

1.适用品种:

该抗体可用于人类,兔,大鼠和其他动物的组织样品,因为脂质氧化与物种无关。

但是,如果您打算将其应用于小鼠组织,则在染色前需要封闭内部小鼠IgG。例如,Vector MOM免疫检测试剂盒(代码PK2200)可用于阻断小鼠IgG。

 2.免疫组织化学:

协议在这里可用。

抗HEL抗体在HUVEC上的应用

Maeda R等,Hypertens Res 31(1)p141-151(2008)

3.蛋白质印迹:

抗HEL抗体可以用于蛋白质印迹。由于在具有赖氨酸残基的任何蛋白质中均可形成HEL加合物,因此将检测到多个条带。

[参考]:H. Arai,Y。Kato,K。Fukunaga,S。Mohri和K. Nakamura:在氧化的人极低密度脂蛋白中形成Nepsilon-(己壬基)赖氨酸。J.电泳48,p37-40(2004)

4.对大鼠肾脏的应用实例:

组织:大鼠肾脏顺铂治疗。

一抗:x 75稀释度

抗原修复:

无二抗:Histofine®SimpleStain Rat(M), Nichirei公司

[参考]:Sugiyama A等。al .; 兽医医学杂志。73(6),p821-826(2011)


抗4-HNE单克隆抗体

1.适用品种:

该抗体可用于人,兔,大鼠和其他动物的组织样品,因为脂质氧化与物种无关。

但是,如果您打算将其应用于小鼠组织,则在染色前需要封闭内部小鼠IgG。例如,Vector MOM免疫检测试剂盒(代码PK2200)可用于阻断小鼠IgG。

2.免疫组织化学:

可在此处获得IHC协议。

4-HNE是在脂质过氧化过程中产生的,可能与蛋白质中的Lys / His / Arg残基反应形成稳定的加合物。抗4-HNE抗体(克隆HNEJ2)主要与4-HNE-His加合物反应。细胞质可以被该抗体染色,但是在某些情况下,核也可以被染色。最近,据报道4-HNE会形成DNA加合物,这种抗体可能会与它们发生反应。

3.蛋白质印迹:

该抗体可以用于蛋白质印迹。请尝试使用比免疫组织化学更低的抗体浓度。例如,2.15-15 µg / mL。通过蛋白质印迹可以检测到多个条带,因为4-HNE可能与各种蛋白质反应。4-HNE本身的分子量为156.2 Da。

[参考文献]

对4-羟基-2-壬烯基组氨酸加合物具有特异性的单克隆抗体。

FEBS Lett。Vol.359,p189-191(1995),S Toyokuni等。等

高糖和甲基乙二醛对永生化成年小鼠雪旺细胞活力和多元醇代谢的差异作用。

Open Diabetes J.1,p1-11(2008),K Sango等。等

纯化的4-HNE可从Cayman Chemical获得。

4.流式细胞仪:

如果在细胞表面存在4-HNE修饰的蛋白质,则可以将该抗体应用于流式细胞仪。但是很抱歉,我们没有任何数据。


抗丙烯醛(ACR)抗体

1.免疫组织化学:

1)将石蜡切片脱蜡并重新水化。

2)将切片用3%过氧化氢淬灭几分钟,在PBS中漂洗,用在PBS中的3%非免疫动物血清预处理30分钟。

3)将切片与抗体以1 µg / mL的稀释液在4℃孵育过夜。

4)根据生产商的说明,使用Vectastain ABC试剂盒(Vector,Burlingame,CA),通过抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化物酶复合物方法显现抗体结合。

5)使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发色剂。

6)使用苏木精或曙红作为抗污剂。


技术说明:

1)省略第一抗体的部分用作阴性反应对照。

2)对于冷冻材料,将样品固定在10%福尔马林中,浸入PBS中的30%蔗糖中,包埋在OCT(日本,樱花,东京)中,并在-80°C下保存。

3)对于石蜡包埋材料,将样品固定在10%福尔马林中,脱水,包埋在石蜡中,然后在室温下保存。

4)微波处理可改善目标染色,但可减少非特异性背景。

5)蛋白酶K处理可降低目标染色。


阳性对照:

糖尿病肾病肾组织中的主动脉壁或动脉粥样硬化的主动脉壁。

2.纯化的丙烯醛:

丙烯醛可得自Sigma-Aldrich.

3.蛋白质印迹:

丙烯醛(烟草烟雾和与年龄相关的氧化应激的一种成分)的修饰介导了人类载脂蛋白E的功能损伤。Tamamizu-Kato S等。等 生物化学。46(28),p8392-8400(2007)


抗丙二醛(MDA)抗体

1.免疫组织化学:

1)将石蜡切片脱蜡并重新水化。

2)将切片用3%过氧化氢淬灭几分钟,在PBS中漂洗,用在PBS中的3%非免疫动物血清预处理30分钟。

3)将切片与抗体以1 µg / mL的稀释液在4℃孵育过夜。

4)根据制造商的说明,使用Vectastain ABC试剂盒(Vector,Burlingame,CA),通过抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化物酶复合物方法使抗体结合可视化。

5)使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发色剂。

6)使用苏木精或曙红作为复染。


技术说明

1)省略第一抗体的部分用作阴性反应对照。

2)对于冷冻材料,将样品固定在10%福尔马林中,浸入PBS中的30%蔗糖中,包埋在OCT(日本,樱花,东京)中,并在-80°C下保存。

3)对于石蜡包埋材料,将样品固定在10%福尔马林中,脱水,包埋在石蜡中,然后在室温下保存。

4)微波处理可改善目标染色,但可减少非特异性背景。

5)蛋白酶K处理可降低目标染色。


Anti 4-hydroxy-2-hexenal (4-HHE) antibody

免疫组织化学。

1)将石蜡切片脱蜡并重新水化。

2)将切片用3%过氧化氢淬灭几分钟,在PBS中漂洗,用在PBS中的3%非免疫动物血清预处理30分钟。

3)将切片与抗体以1 µg / mL的稀释液在4℃孵育过夜。

4)根据制造商的说明,使用Vectastain ABC试剂盒(Vector,Burlingame,CA),通过抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化物酶复合物方法使抗体结合可视化。

5)使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发色剂。

6)使用苏木精或曙红作为复染。


技术说明

1)省略第一抗体的部分用作阴性反应对照。

2)对于冷冻材料,将样品固定在10%福尔马林中,浸入PBS中的30%蔗糖中,包埋在OCT(日本,樱花,东京)中,并在-80°C下保存。

3)对于石蜡包埋材料,将样品固定在10%福尔马林中,脱水,包埋在石蜡中,然后在室温下保存。

4)微波处理可改善目标染色,但可减少非特异性背景。

5)蛋白酶K处理可降低目标染色。


Anti Crotonaldehyde (CRA) antibody

免疫组织化学:

1)将石蜡切片脱蜡并重新水化。

2)将切片用3%过氧化氢淬灭几分钟,在PBS中漂洗,用在PBS中的3%非免疫动物血清预处理30分钟。

3)将切片与抗体以1 µg / mL的稀释液在4℃孵育过夜。

4)根据制造商的说明,使用Vectastain ABC试剂盒(Vector,Burlingame,CA),通过抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化物酶复合物方法使抗体结合可视化。

5)使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发色剂。

6)使用苏木精或曙红作为复染。


技术说明

1)省略第一抗体的部分用作阴性反应对照。

2)对于冷冻材料,将样品固定在10%福尔马林中,浸入PBS中的30%蔗糖中,包埋在OCT(日本,樱花,东京)中,并在-80°C下保存。

3)对于石蜡包埋材料,将样品固定在10%福尔马林中,脱水,包埋在石蜡中,然后在室温下保存。

4)微波处理可改善目标染色,但可减少非特异性背景。

5)蛋白酶K处理可降低目标染色。


Anti Methyl glyoxal (MG) antibody

1.免疫组织化学:

1)将石蜡切片脱蜡并重新水化。

2)将切片用3%过氧化氢淬灭几分钟,在PBS中漂洗,用在PBS中的3%非免疫动物血清预处理30分钟。

3)将切片与抗体以1 µg / mL的稀释液在4℃孵育过夜。

4)根据制造商的说明,使用Vectastain ABC试剂盒(Vector,Burlingame,CA),通过抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化物酶复合物方法使抗体结合可视化。

5)使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发色剂。

6)使用苏木精或曙红作为复染。


技术说明

1)省略第一抗体的部分用作阴性反应对照。

2)对于冷冻材料,将样品固定在10%福尔马林中,浸入PBS中的30%蔗糖中,包埋在OCT(日本,樱花,东京)中,并在-80°C下保存。

3)对于石蜡包埋材料,将样品固定在10%福尔马林中,脱水,包埋在石蜡中,然后在室温下保存。

4)微波处理可改善目标染色,但可减少非特异性背景。

5)蛋白酶K处理可降低目标染色。

2.蛋白质印迹:

该抗体可以用于蛋白质印迹。

参考: Argpyrimidine,人晶状体蛋白中的蓝色荧光团:白内障白内障晶状体中含量高。

Padayatti PS,Ng AS,Uchida K,Glomb MA,Nagaraj RH

Invest Ophthalmol Vis Sci。42(6),p1299-1304。(2001年)


抗7-酮胆固醇(7-KC)抗体

1.免疫组织化学:

1)用PBS洗涤OCT化合物。

2)将冷冻的切片用添加有3%过氧化氢的1%EDTA淬灭几分钟,在PBS中漂洗,用在PBS中的3%非免疫动物血清预处理30分钟。

3)将切片与抗体以10 µg / mL的稀释度在4℃孵育过夜。

4)根据制造商的说明,使用Vectastain ABC试剂盒(Vector,Burlingame,CA),通过抗生物素蛋白-生物素-免疫过氧化物酶复合物方法使抗体结合可视化。

5)使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐作为发色剂。

6)使用苏木精或曙红作为复染。


技术说明:

1)仅冷冻材料。

2)省略第一抗体的部分用作阴性反应对照。

3)对于冷冻材料,将样品固定在10%福尔马林中,浸入PBS中的30%蔗糖中,包埋在OCT(日本东京,樱花)上,并在-80°C下保存。

2.解决条件:

为了将新鲜组织固定在5毫米厚的区域内,建议使用20%福尔马林24至48小时。

3.EDTA用于H2O2处理。

如果使用Milli-Q水,则不需要EDTA。但是,如果EDTA影响您的染色结果,请为过氧化氢溶液添加1%EDTA。

4.内部抗生物素蛋白的阻断

抗生物素蛋白封闭剂可从Vector Laboratories获得。

5.二抗:

稀释因子可能会有所不同,具体取决于您实验室中使用的试剂盒。例如,将x5000稀释至x10000兔抗小鼠IgG或山羊抗小鼠IgG,并在室温下孵育2小时。请参考制造商的说明。

6.样品的厚度

我们建议准备3至7 µm的厚度。

7.酯化的7-酮胆固醇

由于酯化的7-KC具有高度疏水性,因此尚未测试对酯化的7-KC的反应性。


二酪氨酸(DT)ELISA

1.试剂的稳定性:

打开包装后,所有组件将稳定一周。

2.应用于动物尿液

小鼠尿液:

建议用生理盐水稀释20倍。


抗二酪氨酸(DT)抗体

1.适用品种:

该抗体可用于人,兔,大鼠和其他动物的组织样品,因为脂质氧化与物种无关。

但是,如果您打算将其应用于小鼠组织,则在染色前需要封闭内部小鼠IgG。例如,Vector MOM免疫检测试剂盒(代码PK2200)可用于阻断小鼠IgG。

2.蛋白质印迹:

一抗的浓度为0.1-1.0 µg / mL。

会观察到多条带或涂片染色,因为多种蛋白质可能会被氧化破坏,并且可能会发生切割,交联或聚集。

3.制备阳性对照:

可以通过以下方法制备二酪氨酸修饰的蛋白:

镜头蛋白(例如Sigma-Aldrich,编号C4163):0.5 mg / mL

H 2 O 2:5 mmol / L

CuSO 4:0.05 mmol / L

在70℃下孵育数小时在0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中的37°C。

用EDTA终止反应(终浓度为0.1 mM)。

用磷酸盐缓冲液透析。

4.大鼠肾脏的应用示例:

组织:10%福尔马林固定。

H 2 O 2预处理:3%

抗:x 100稀释度(1 µg / mL),在4°C过夜。

扩增:Nichirei公司的SimpleStain®MAX-PO(M)。R / T 30分钟。

酶/底物:过氧化物酶/ DAB

[参考]:Kimoto Y等。al .; 兽医医学杂志。73(3),p403-407(2011)


抗二溴酪氨酸(DiBrY)抗体

适用品种:

该抗体可用于人,兔,大鼠和其他动物的组织样品,因为脂质氧化与物种无关。

但是,如果您打算将其应用于小鼠组织,则在染色前需要封闭内部小鼠IgG。例如,Vector MOM免疫检测试剂盒(编号PK2200)可用于阻断小鼠IgG。


潜在抗氧化剂(PAO)检测试剂盒

1.适用于人血清

问:如何保存血清样本以进行PAO分析?

答:请准备新鲜的血清或新鲜的血浆。请冷冻保存在-20°C以下,因为某些抗氧化剂(例如抗坏血酸,尿酸和辅酶Q 10)不稳定。

问:血浆样品是否适用于PAO分析?

答:可以使用含肝素的血浆样品,但不能使用EDTA血浆。

根据我们的研究,通过PAO分析测得的抗氧化剂平均值为1069 µmol / L。

2.应用于尿液样本

PAO分析可应用于尿液样本。但是请注意尿酸的浓度超过2 mmol / L,需要用蒸馏水稀释。尿液中抗氧化剂的重要性尚不清楚。

3.适用于食品样品:

1)红酒:测定前用蒸馏水稀释x 8(测定例为45,479 µmol / L)。

2)日本酒:测定前用蒸馏水将x1至x8稀释(测定例为18至211 µmol / L)。

3)红茶:测定前用蒸馏水稀释x 8。

4)咖啡:测定前用蒸馏水稀释x 28。

5)绿茶:测定前用蒸馏水稀释x 8或更多(测定例为8,728至60,816 µmol / L)

4.可检测到抗氧化剂。

PAO检测法至少可以检测以下物质:

抗坏血酸,trolox,维生素E,谷胱甘肽,胆红素,尿酸,cathecin,β-胡萝卜素和其他多酚。

5.编制标准。

问:无法绘制标准曲线。

答:尿酸粉末用作标准品。使用前请注意将尿酸完全溶解。小瓶中使用的蒸馏水量不同。请确认标准标签上印刷的容量。

问:如何存储溶解的标准液?

答:标准溶液(2mM尿酸)可以在-20°C以下冷冻保存。避免冻结/解冻循环。

问:要计算抗氧化能力,为什么要将2189乘以尿酸当量浓度?

答:从尿酸当量转化为还原铜离子的能力。

6.卵巢子宫内膜瘤的检测实例:

抗氧化能力(PAO)可用于评估卵巢子宫内膜瘤。

卵巢子宫内膜瘤:1197µmol/L

浆液性囊腺瘤:672µmol/L

粘液性囊腺瘤:424µmol/L

参考文献:S Fujii, 31th meeting of Japan BioIron Sociery, Abstruct in Japanese p9-10 (2007)

7.参考波长:

620-660 nm用于参考波长。


铁含量测定试剂盒(铁锌法)Fe / Iron Assay Kit (ferrozine method)

样品储存条件:

组织样本应以组织块或匀浆形式在-80°C下冷冻保存。

请避免使用防腐剂,抗冻剂,福尔马林,螯合剂(如EDTA等)。

如果可能,请用盐水重整血液。

冷冻的组织可以储存至少几个月。


铁含量测定试剂盒(Nitroso-PSAP方法) Code:CFE-010)Fe / Iron Assay Kit (Nitroso-PSAP method)

应用于组织样本:

CFE-010可应用于细胞裂解物和组织匀浆。

加入5%TCA溶液。请确认混合物的pH值为pH2-3。

在4-8°C下孵育30分钟。

以6,000 rpm离心15分钟。

收集上清液,并应用于CFE-010。


注意:酸提取后应进行离心。


铜分析试剂盒 Cu / Copper Assay Kit (3,5-DiBr-PAESA), 编号CCU-400

1.应用于培养细胞:

CCU-400可应用于培养基和细胞匀浆。请注意,螯合剂(如EDTA)可能会干扰该测定。


[测定实例]

1)加入终浓度为0.1 M的HCl,萃取15分钟-过夜。

2)在4°C下以5,000-10,000 rpm离心15分钟

3)收集上清液,并用于CCU-400分析。

2.老化的冷冻组织:

问: 我们已经将组织冷冻在液氮中冷冻了6个月以上。

我们可以使用这种样本吗?

答: 是的,但是请避免冻结/解冻循环。


锌检测试剂盒 Zn / Zinc Assay Kit (5-Br-PAPS)

应用于植物材料(酸提取)

酸提取的典型方案:

1)准备植物匀浆。

2)加入终浓度为0.01-0.1 mol / L的盐酸(HCl)或硝酸。

3)剧烈混合并静置1小时。

4)在4摄氏度下以5,000-10,000 rpm离心混合物10分钟,以去除不溶物。

5)适用于Zn分析试剂盒。


在应用植物材料中,提取过程将需要细胞壁的分解。请注意将匀浆制备成足以有效提取的碎片。可以根据样品的性质修改实验条件。

如果您打算检测有机锌(酸无法提取有机锌),或要用于富含螯合剂的材料,请联系我们的技术支持。


钙含量测定试剂盒(氯膦偶氮Ⅲ)Ca / Calsium Assay Kit (Chlorophosphonazo III)

1.适用于骨骼样品:

1)用盐水清洗骨骼样品,使其干燥并测量重量。

2)将0.1g均质的骨样品与1mL的0.1M HCl混合,并摇动过夜。

3)在4°C下以10,000 rpm离心10分钟,并收集上清液。

4)应用于Ca检测试剂盒(将需要稀释)。

应根据您的样品优化实验条件,例如提取时间,HCl浓度和体积。如果要使用更高浓度的HCl,请使用NaOH溶液将pH值调节在2至3之间。

2.脱钙骨样本1)在200°C下加热,用硝酸和过氧化氢裂解酸。

2)用0.1M HNO 3溶解干燥的样品。

3)用NaOH溶液将pH值调节在2至3之间。

4)应用于Ca检测试剂盒(将需要稀释)。


钙含量测定试剂盒 Ca / Calsium Assay Kit (o-Cresolphtalein-Complexone: OCPC) CCA-030

1.适用于骨骼样品:

1)用盐水清洗骨骼样品,使其干燥并测量重量。

2)将0.1g均质的骨样品与1mL的0.1M HCl混合,并摇动过夜。

3)在4°C下以10,000 rpm离心10分钟,并收集上清液。

4)应用于Ca检测试剂盒(将需要稀释)。


应根据您的样品优化实验条件,例如提取时间,HCl浓度和体积。如果要使用更高浓度的HCl,请使用NaOH溶液将pH值调节在2至3之间。

2.脱钙骨样本

1)在200°C下加热,用硝酸和过氧化氢裂解酸。

2)用0.1M HNO 3溶解干燥的样品。

3)用NaOH溶液将pH值调节在2至3之间。

4)应用于Ca检测试剂盒(将需要稀释)。

3.粪便样本:

1)将粪便均质化为粉末或小颗粒。

2)将0.1g均质粪便样品与1mL 0.1M HCl混合,并摇动30分钟。

3)在4°C下以10,000 rpm离心10分钟,并收集上清液。

4)涂在Ca分析试剂盒上(要稀释,请使用0.1 M HCl)。


提取将取决于时间。请注意所有样品的提取时间要相同。