人免疫球蛋白M(IgM) ELISA试剂盒

人免疫球蛋白M(IgM) ELISA试剂盒适用于体外定量检测人血清、血浆、细胞培养和组织样品中免疫球蛋白M(IgM)浓度。

检测方法：Sandwich ELISA(Quantitative)
样本类型：Serum, plasma, Cell culture supernatant and tissue samples
反应物种：人
检测目标：IgM
样本量：50-100 µl
读数：450 nm
特异性：经检测与其它相似物质无明显交叉反应
检测范围：2000-31.2 ng/ml
灵敏度：最小可测值<12 ng/ml
批内差：CV<8%
批间差：CV<10%
回收率：80-120%
储存条件：2-8℃,6个月。

检测原理：
人免疫球蛋白M(IgM) ELISA试剂盒基于双抗体夹心ELISA(Sandwich ELISA)酶联免疫吸附测定技术(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)。酶标板预先包被的抗体为免疫球蛋白M(IgM)单克隆抗体，检测相抗体为多克隆抗体，经生物素（biotin）标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，经PBS或TBS洗涤，随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的待测因子呈正相关。


试剂盒组分：
预包被酶标板（可拆卸）；标准品；浓缩生物素化抗体；浓缩酶结合物(ABC)；酶结合物(ABC)稀释液；抗体稀释液；标准品稀释液；样品稀释液；浓缩洗涤液(25×)；显色剂A；显色剂B；终止液

需自备物品：
1. 酶标仪(450 nm检测波长滤光片，570 nm或630 nm校正波长滤光片) ；
2. 洗板机（可调注液量，保证每孔350 μl洗液而不溢出）；
3. 高精度单道加液器（量程为0.5-10 μl, 2-20 μl,20-200 μl,200-1000 μl)；
4. 高精度多道加液器（8道或12道，量程为50-300 μl)；
5. 37℃恒温箱；
6. 低温离心机；
7. 纯净水或蒸馏水。

标本收集：
1. 收集血液的试管应为一次性的无热原、无内毒素试管；
2. 血清和血浆避免使用溶血、高血脂标本；
3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除；
4. 标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20℃，-80℃冰箱内，避免反复冻融；
5. 可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释(建议做预实验，以确定稀释倍数) ；
6. 收集标本，尽量做到双份的用量，避免一次实验失败，重复实验时标本缺失，从而耽误实验进程；
7. 收集标本时，应该做好防护措施（比如戴手套，口罩，护目镜等），因为所有标本都具有一定的潜在危险性；
8. 样本处理应该在生物安全柜里面，并且正确使用生物安全柜。

标本处理：
1. 血清：将采集的全血静置冰箱4℃过夜，然后1000-3000 rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不检测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
2.血浆：用EDTA，枸橼酸钠，肝素等作为抗凝剂，加入血液混匀后，1000-3000 rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不检测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
3. 组织匀浆：切取组织块，0.01M PBS中过洗一次；按照1G组织加入5-10 ml组织蛋白萃取试剂的比例，在冰水中匀浆。匀浆完成后，5000-10000 rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不检测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
4. 细胞培养上清：1000-3000 rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不检测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
5. 尿液，腹水，脑脊液等：1000-3000 rpm离心10分钟，取上清立即测试，暂时不检测可以放入-20℃（1-3个月）或-80℃（3-6个月）保存；
注：样品稀释的一般原则：
用户须查阅相关文献了解标本内待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。样品的稀释应有详细记录。

准备工作：
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温后方可进行试验；
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回 ；
3. 标准品: 加入标准品稀释液1.0ml至冻干标准品中，静置10分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀，之后在管身标注①，然后根据需要进行稀释注意：务必要保证冻干标准品彻底溶解和混匀。
4. 标准品稀释方法： 取7支洁净的试剂管，分别标注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧. 每管加入300 μl标准品稀释液。从第①管内取出300 μl加入到第②管，混匀后，再从第②管取出300 μl加入到第③管，以此类推至第⑦管。第⑧管为标准品稀释液，作为阴性对照使用。
5. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需用量，用抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:100)，配置成生物素化抗体工作液。使用前30分钟准备，仅供当日使用；
6. 酶结合物工作液：按当次试验所需要用量，用酶结合物稀释液稀释浓缩酶结合物(1:100)，配置成酶结合物工作液。使用前30分钟准备，仅供当日使用；
7. TMB显色工作液：在使用之前30分钟，按TMB显色液A x 9份加TMB显色液B x 1份（9：1）的比例配制TMB显色工作液。

洗涤方法：
1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350 μl，注入与吸出间隔20－30秒。确保机器运用熟练后，再投入实验中使用；
2. 手工洗板：每孔加洗涤液350 μl，静置30秒后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干。手工洗板时，注意加入洗液的过程中，不要造成孔间污染，从而出现跳孔的现象。

操作步骤：
1. 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内封存于2-8℃；
2. 预留空白孔（若使用双波长读板，空白孔可以不设）；
3. 分别将标本或不同浓度的标准品（0 ng/mL孔加标准品稀释液）加入相应孔中(100 μl/孔)， 37℃孵箱孵育90分钟；
4. 提前30分钟制备生物素化抗体工作液；
5. 洗板2次；
6. 加入生物素化抗体工作液(100 μl/孔)，37℃孵箱孵育60分钟；
7. 提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置；
8. 洗板3次；
9. 除空白孔外，加入酶结合物工作液(100 μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分钟；
10. 洗板5次；
11.加入TMB显色工作液（包括空白孔）100 μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，当标准曲线高浓度的颜色较深，有明显的颜色梯度的时候，即可终止。试验显色反应请勿超过30分钟；
12.加入终止液（包括空白孔）100 μl/孔，混匀后即刻测量OD（450 nm）值(10分钟内)。

结果判断：
1．每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值（若不减零孔值，标准曲线的零孔应相交于Y轴）；
2．手工绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3进行结果计算；
3．若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。