钙离子指示剂
Calcium Indicators

基于细胞的钙流检测法被广泛应用于高通量筛选（HTS）中，用于确定通过G蛋白偶联受体（GPCR）的激动剂刺激和拮抗剂抑制信号传导。GPCR是一个庞大的整合膜蛋白家族，也是药物发现中重要的靶点类别。精确测量细胞内钙离子浓度和动员情况，有助于更全面地理解钙调控的信号通路、细胞功能和病理过程。

AAT Bioquest已开发出种类最全的钙离子指示剂，包括Fluo-8®、Cal-520®和Calbryte™钙离子指示剂，以及用于追踪钙离子动员的钙流检测试剂盒，这些产品能够提供强烈的荧光信号，并覆盖从紫外到红外多种波长选择。

定量胞质钙离子
Quantifying Cytosolic Calcium

钙是一种普遍存在的信使，影响众多信号转导通路，包括钙诱导的蛋白质构象变化、胞质和细胞器钙水平的调控、钙介导信号转导的高度局部特性及其在兴奋性、胞吐作用、运动性、细胞凋亡和转录中的特定作用。这些通路调控许多关键细胞过程，包括神经传递、细胞增殖和肌肉收缩。在细胞外液的正常条件下，静息状态下的胞质钙浓度相对较低，约为100 nM或更低。钙信号通过细胞内钙库释放钙离子，或通过质膜离子通道流入胞外钙离子而被激活。受刺激的细胞可将胞质钙浓度瞬时升高至数百纳摩尔范围，峰值水平通常达到约500–1000 nM，具体取决于细胞类型、刺激强度和信号通路。

图1
	活Raw 264.7细胞荧光图像：使用Cal-520®-Dextran Conjugate MW 10,000（货号20601，绿色）标记溶酶体Ca²⁺，LysoBrite™ Red（货号22645，红色）标记溶酶体，Nuclear Violet™ LCS1（货号17543，蓝色）标记细胞核

用于活细胞钙成像的荧光AM酯衍生物
Fluorescent AM Ester Derivatives for Live Cell Calcium Imaging

在结合钙离子后显示光谱响应的荧光指示剂，使研究人员能够通过荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱和荧光微孔板读数仪研究细胞内游离钙浓度的变化。为便于检测细胞内钙动员并促进被动扩散，将乙酰氧基甲酯（AM酯）官能团连接到钙离子指示剂的核心结构上。这增加了指示剂的疏水性，使其易于穿透完整的质膜，并通过最小化非特异性背景荧光来增强指示剂灵敏度，因为AM酯共轭指示剂在胞内酯酶切除酯基之前荧光较弱且无法结合钙离子。

一旦探针进入活细胞并且仅在胞内酯酶去除AM酯官能团后，活性即被启动。一旦被激活，探针将螯合游离的细胞内Ca²⁺，并发生与胞质钙浓度成比例的荧光强度变化。诸如Fluo-8® AM（货号21080）、Cal-520® AM（货号21131）和Calbryte™ 520 AM（货号20653）等指示剂已被广泛用于钙成像、钙流检测和用于药物发现的基于细胞的高通量筛选（HTS）检测。钙离子指示剂适用于流式细胞术、荧光显微镜和荧光微孔板平台，其适用性取决于探针动力学、亮度、留滞性和仪器配置。除了提供荧光和发光钙离子指示剂外，我们还提供几种非荧光钙信号分子和螯合剂，用于测量和操纵细胞内外的钙离子。

单波长钙离子指示剂
Single-Wavelength Calcium Indicators

单波长钙离子指示剂广泛用于监测钙动员、成像钙信号的空间动态，以及用于GPCR激动剂刺激和拮抗剂抑制信号传导的HTS细胞药理学筛选。这些指示剂在饱和钙水平下表现出显著的钙依赖性荧光强度变化，而不会改变其吸收或发射波长。我们已经开发了多种新型钙离子指示剂，包括Fluo-8®系列、Cal-520®系列和Calbryte™系列，旨在以高信背比荧光响应追踪钙动员。

关键特点

» 在静息钙水平下背景荧光最小

» 信背比得到改善

» 大大增强的细胞内留滞性

» 用于活细胞钙分析的细胞通透性形式（兼容成像、流式细胞术和微孔板检测，如HTS）

» 用于通过显微注射、膜片钳或胞饮加载的细胞不通透性形式

» 紫外（UV）、紫光和白光可激发的形式

» 低、中、高亲和力形式提供灵敏度范围以满足多种应用

图2
	用Calbryte™ 630 AM测量ATP诱导的细胞内钙释放。细胞在37°C下与Calbryte™ 630 AM染料孵育30分钟，然后向细胞中加入10 µM ATP。获取基线，并在加入ATP后分析其余细胞。随时间记录响应。该分析在NovoCyte™ 3000流式细胞仪APC通道上进行

红色荧光钙离子指示剂
Red Fluorescent Calcium Indicators

亲和力和特异性是钙探针最重要的考虑因素，其他因素如细胞毒性和细胞通透性也很重要。颜色也是不容忽视的方面，必须适合实验设计。红移钙探针的光谱与FITC、Alexa Fluor® 488和GFP的光谱完全分离，使其成为多重检测的理想选择。Rhod-2是红色荧光钙离子指示剂中最常用的。然而，Rhod-2 AM在活细胞中酯酶水解后的荧光仅为中等强度，且细胞钙响应非常小。其他红色探针如Cal-590™已被开发出来，以改善细胞负载和钙响应，同时保持光谱特性，使其兼容常见的TRITC/Cy3®滤光片组。

图3
	CHO-K1细胞过夜培养。在培养基中加入终浓度为5 µM的Calbryte™ 590 AM染料工作液并加入Pluronic® F-127（在HH缓冲液中制备2X溶液后加入细胞）。细胞在37°C孵育60分钟。用HH缓冲液洗涤一次，加入HH缓冲液并在室温孵育30分钟。加入不同浓度的ATP，使用FlexStation 3在Ex/Em=540/590 nm、cutoff=570 nm条件下测量响应

比率型钙离子指示剂
Ratiometric Calcium Indicators

与单波长指示剂相比，比率型（或双波长）指示剂在结合钙离子时具有独特的光谱特性。当结合钙离子时，比率型指示剂会经历其最佳吸收或发射波长强度的位移。例如，双激发钙指示剂Fura-2 AM和Fura-8™ AM在结合或游离钙时分别显示出两个激发峰。当在钙结合和钙游离的峰值激发波长下激发时，钙浓度的增加分别引起双激发指示剂荧光发射强度的增加和减少。

关键特点

» 比率测定可精确测量细胞内钙浓度

» 最小化染料负载不均、染料渗漏、光漂白和细胞厚度变化（在混合群体中常见）的影响

» 提供更稳健和可重复的结果

» 指示剂有双激发、双发射或双激发与双发射形式可供选择

» 可作为膜通透性AM酯（兼容成像、流式细胞术和微孔板检测，如HTS）

» 可作为膜不通透性盐衍生物，用于通过显微注射、膜片钳或胞饮加载

图4
	用Fura-2 AM（货号21023）和Fura-8™ AM（货号21056）在CHO-K1细胞中测量的ATP剂量响应。CHO-K1细胞以40,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于黑壁透明底96孔板，然后与Fura-2 AM或Fura-8 AM钙检测染料负载溶液孵育1小时。通过Flexstation加入ATP剂量

Calbryte™ 钙离子指示剂
Calbryte™ Calcium Indicators

Calbryte™系列是用于监测细胞内钙动员的最亮且最稳健的钙指示剂系列。它包括三种新型钙指示剂Calbryte™ 520、Calbryte™ 590和Calbryte™ 630，主要区别在于它们的吸收和发射波长。Calbryte™探针以显著更高的信背比特征发射荧光信号，并具有大大增强的细胞内留滞性。Calbryte™系列已针对荧光显微镜、荧光微孔板读数仪和流式细胞仪进行了优化。它们也可用于高通量筛选应用。

有关Calbryte™钙指示剂系列的更多信息，请参见此处。

关键特点

» 经过验证的性能，卓越的信噪比和细胞内留滞特性

» 在相同条件下，Calbryte™探针明显比其他任何钙指示剂更亮

» 信背比大幅改善

» 增强的细胞内留滞性，无需使用丙磺舒

» 快速便捷的细胞负载，仅需45至60分钟

» 均匀的胞质定位

» 红移的Calbryte™ 590和Calbryte™ 630可与GFP或其他绿色荧光染料用于多重检测

» 可作为膜通透性AM酯（兼容成像、流式细胞术和微孔板检测，如HTS）

» 可作为膜不通透性盐衍生物，用于通过显微注射、膜片钳或胞饮加载

» 可作为反应性染料用于与载体偶联

图5
	在CHO-K1细胞中测量的无需丙磺舒的ATP诱导钙响应。加入100 µL溶于HH缓冲液的10 µg/mL Calbryte™-520 AM或溶于HH缓冲液的10 µg/mL Fluo-4，在37°C孵育45分钟。然后移除染料负载液，替换为200 µL HH缓冲液/孔。通过FlexStation 3加入卡巴胆碱（50 µL/孔）以达到所示的终浓度

图6
	用Calbryte™ 520 AM和Fluo-4 AM在CHO-M1细胞中测量的卡巴胆碱剂量响应。CHO-M1细胞以50,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于96孔黑壁透明底Costar板。加入100 µL溶于HH缓冲液的10 µg/mL Calbryte™ 520 AM或溶于HH缓冲液的10 µg/mL Fluo-4，在37°C孵育45分钟。然后移除染料负载液，替换为200 µL HH缓冲液/孔。通过FlexStation 3加入卡巴胆碱（50 µL/孔）以达到所示的终浓度

Cal-520® 钙离子指示剂
Cal-520® Calcium Indicators

Cal-520®钙指示剂系列是最全面的荧光钙敏感染料组合。它包括六种独特的指示剂Cal-500™、Cal-520®、Cal-590™、Cal-630™、Cal-670™和Cal-770™，主要区别在于它们的吸收和发射波长。每种指示剂在静息钙水平下发射的荧光最小，在优化的实验条件下，在饱和Ca²⁺浓度下可表现出大于100倍的荧光增强。Cal-520®系列指示剂可作为膜通透性AM酯、膜不通透性盐衍生物和葡聚糖偶联物。

有关Cal-520®和Cal™钙指示剂系列的更多信息，请参见此处。

关键特点

» 比Fluo-3、Fluo-4、Rhod-2和Rhod-5更高的信背比

» 增强的细胞内留滞性

» 便捷高效的细胞负载

» 均匀的胞质定位

» 红移的Cal-590™、Cal-630™、Cal-670™和Cal-770™可与GFP或其他绿色荧光染料用于多重检测

» Cal-770™可用于活体研究

» 可作为膜通透性AM酯（兼容成像、流式细胞术和微孔板检测，如HTS）

» 可作为膜不通透性盐衍生物，用于通过显微注射、膜片钳或胞饮加载

» 可作为反应性染料用于与载体偶联

图7
	在无丙磺舒条件下，分别用Cal-520® AM（红色曲线）或Fluo-4 AM（蓝色曲线）孵育的CHO-K1细胞中，内源性P2Y受体对ATP刺激的钙响应。CHO-K1细胞以50,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于Costar黑壁透明底96孔板。向细胞中加入100 µL溶于HHBS（含或不含丙磺舒）的5 µM Fluo-4 AM或Cal 520® AM，在37°C孵育1小时。通过FlexStation加入ATP（50 µL/孔）以达到所示的终浓度

Fluo-8® 钙离子指示剂
Fluo 8® Calcium Indicators

Fluo-8® AM解决了基于fluo的染料常见的主要局限之一，即细胞负载所需的苛刻条件。传统的基于fluo的染料如Fluo-2 AM（货号20495）、Fluo-3 AM（货号21013）和Fluo-4 AM（货号20550）需要在37°C下与细胞孵育长达一小时才能进行读数。这不仅使细胞暴露于苛刻的温度，还要求用户花费时间加热和冷却细胞培养物。此外，它将孵育温度作为一个可能的混杂变量引入。Fluo-8® AM通过提供一种可在室温下负载到细胞中的稳健钙指示剂，解决了所有这些问题。Fluo-8® AM比其他基于fluo的染料对温度的依赖性更低，从而在更广泛的实验条件下获得更一致的结果。此外，孵育时间最短仅需20分钟，Fluo-8® AM可实现快速周转，提高生产效率。最棒的是，即使进行了结构修饰和改进，Fluo-8® AM的光谱特性保持不变，保持了Fluo-4 AM熟悉的光谱（即Ex/Em = 494/517 nm）。

有关Fluo-8®钙指示剂系列的更多信息，请参见此处（保留原文内链）。

关键特点

» 更快的细胞负载和孵育方案

» 可在室温下轻松负载到细胞中，而Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37°C的负载温度

» 比Fluo-4 AM亮两倍，比Fluo-3 AM亮四倍

» 与Fluo-4和Fluo-3相同的光谱使升级变得容易

图8
	在HEK-293细胞中测量的卡巴胆碱剂量响应。HEK-293细胞以40,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于Costar黑壁透明底96孔板。使用Fluo-8® AM（货号21083）或Fluo-4 AM（货号20550）的染料负载液（100 µL）在室温下与细胞孵育1小时。通过NOVOstar（BMG Labtech）加入卡巴胆碱（50 µL/孔）以达到所示的终浓度

Fluo-3 和 Fluo-4 钙离子指示剂
Fluo-3 and Fluo-4 Calcium Indicators

Fluo-3是一种钙离子指示剂，于1989年首次推出，用于流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜。作为一种类似荧光素的化合物，Fluo-3在缺少游离Ca²⁺时实际上是非荧光的。然而，一旦结合钙离子，Fluo-3在525 nm处的发射强度急剧增加。作为一种指示剂，Fluo-3在细胞信号通路、肌细胞和神经递质激活研究中至关重要。

Fluo-4在Fluo-3的核心结构基础上进行了改造，以提高荧光信号强度。化学结构的修饰导致Fluo-4的激发最大值从506 nm（Fluo-3的激发波长）蓝移至494 nm。实际上，这12 nm的位移将Fluo-4的激发最大值移近标准氩激光器（即488 nm）的波长。这导致更好的激发，从而产生更亮且对钙浓度变化更敏感的荧光信号。

图9
	U2OS细胞以40,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于96孔黑壁透明底Costar板。移除生长培养基，细胞与浓度为4 µM的Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Fluo-8® AM的HHBS溶液在37°C、5% CO₂培养箱中孵育1小时。细胞用200 µL HHBS洗涤两次，然后使用FITC通道在荧光显微镜（Olympus IX71）下成像

用于筛选GPCR和钙通道靶点的钙离子测定
Calcium Assays for Screening GPCR and Calcium Channel Targets

Screen Quest™钙流检测试剂盒是基于细胞的高通量筛选（HTS）中确定通过G蛋白偶联受体（GPCR）的激动剂刺激和拮抗剂抑制信号传导的优先选择方法。迄今为止，市场上约三分之一的药物是针对GPCR设计的。Screen Quest™钙流检测试剂盒提供了一种便捷的免洗、均相荧光检测方法，用于监测GPCR和钙通道，并检测广泛生物靶标中的细胞内钙动员。该检测可在便捷的96孔或384孔微孔板格式中进行，并可轻松适应自动化。Screen Quest™钙流检测试剂盒已针对以下仪器进行了优化和验证：FDSS®、FLIPR®、ViewLux™、NOVOStar、ArrayScan™、FlexStation®和IN Cell Analyzer。

关键特点

» 经广泛微孔板读数仪验证的优化方案

» 卓越的信号强度（高S/B比）和孔间均一性

» 用于检测挑战性细胞系和受体的大检测窗口

» 适用于1536孔板的高性能钙流检测

图10
	使用Screen Quest™ Calbryte™ 520钙检测试剂盒、FLIPR® Calcium 4 Assay（Molecular Devices）和Fluo-4 Direct™ Calcium Assay（Molecular Probes®）在CHO-K1细胞中，内源性P2Y受体对ATP的荧光信号响应比较。CHO-K1细胞以50,000个细胞/100 µL/孔过夜接种于96孔黑壁透明底Costar板。分别使用三种检测方法测量钙流响应。通过FlexStation 3加入ATP（50 µL/孔）以达到所示的终浓度

关于 BioPcr（勃谱科技）

BioPcr（勃谱科技有限公司）为国内客户提供以下服务：

✅ 全系列AAT Bioquest钙离子指示剂现货供应

✅ 专业技术咨询与实验方案优化支持

✅ 快捷的物流配送与完善的售后服务

如需了解具体产品规格、报价或获取选型建议，欢迎联系我们。

联系我们

统一服务热线：400-860-6200
邮箱：sales@biopcr.com
官网：www.biopcr.com